I fitormoni e la crescita di piante carnivore in vitro

questa sarebbe la mia tesina d'esame che ho fatto e che avevo promesso di pubblicare, come vedete non è per niente lunga ( per di più l'ho consegnata a caratteri piccoli) ma ho impiegato un anno per farla. perchè il lavoro per la parte pratica era complesso e difficile..


Michele Palazzo 5° C/A

















I FITORMOINI E LA COLTIVAZIONE IN VITRO DI PIANTE CARNIVORE












Dato il mio interesse per le piante carnivore, specialmente quelle rare, ho cercato un modo per poterle riprodurre facilmente in gran numero e velocemente.
La miglior tecnica utilizzabile è la crescita in vitro, la quale permette da un piccolo ed opportuno espianto della pianta di produrne numerose altre geneticamente uguali, si tratta quindi di una vera e proprio clonazione.
Per quanto riguarda queste coltivazioni è importante tener conto dei fitormoni che vengono utilizzati ad esempio per permettere ai semi di germogliare anche fuori periodo.
I FITORMONI
Le cellule isolate da organi o tessuti vegetali delle piante possono essere indotte a crescere e moltiplicarsi se poste in opportuni condizioni ambientali ( disponibilità di sostanze nutritive e Sali minerali, temperatura e aerazione favorevoli ) inoltre come vedremo più avanti la crescita delle piante può essere manipolata mediante l’uso di fitormoni.
Se in vitro si tratta il tessuto vegetale,pur se già differenziato, con fitormoni quali citochinine ( 0.03mg/L ) e auxina (2,0mg/L ) si ottiene lo sdifferenzionamento delle cellule e lo sviluppo di ammassi amorfi e callosi (Calli) che possono essere mantenute in vitro o possono essere indotte a rigenerare organi o piante intere.
Oltre a ciò si può favorire solo la crescita dei germogli o delle radici, o aumentare la velocità dello sviluppo delle piante.



I fitormoni sono sostanze prodotte dalla pianta,come risposta ad opportuni stimoli sia interni che esterni,vengono poi trasportate in zone più o meno lontane dal luogo di produzione ove condizionano le attività metaboliche della cellula e quindi lo sviluppo di tutto l’organismo.
Questi ormoni sono prodotti inoltre in differente quantità a secondo delle stagioni e questo si manifesta più o meno visibilmente con i cambiamenti stagionali delle piante come la caduta delle foglie in alcune piante o la formazione degli anelli nel tronco, o la maturazione dei frutti ecc..
I fitormoni conosciuti sono classificabili in base alla funzione in tre gruppi principali: auxine,gibberelline e citochinine.
Questi ormoni agiscono principalmente sulla crescita delle cellule vegetali,infatti hanno due modalità di accrescimento: una per semplice divisione cellulare (mitosi) ,quando aumenta il numero delle cellule,da una se ne formano due e così di seguito, e per distensione ciò è per allungamento ed aumento delle dimensioni della singola cellula.
Una volta che le cellule crescono di numero e di grandezza cominciano a differenziarsi dando origine a tutti i diversi tipi di cellule che costituiscono i vari tessuti della struttura della pianta.
AUXINE



La principale auxina è l’acido indoloacetico ottenuto mediante estrazione dalla pianta, vi sono inoltre sostanze isolate in laboratorio tra cui l’acido a-naftalenocetico e l’acido 2,4 diclorofenoossiacetico.
Le auxine naturali sono sintetizzate dalle cellule degli apici vegetali della pianta,da giovani foglie e dai frutti in maturazione.
Gli effetti delle auxine sono diversi:

- determinano l’allungamento dei germogli, ciò è dovuto alla stimolazione delle espansioni cellulari , mentre la divisione cellulare non viene in particolare stimolata.
- Stimola la crescita delle radici, il trattamento con l’auxina è usata per l’appunto in agricoltura per indurre la emissione di radici avventizie
- Inibiscono la caduta delle foglie, per questo le giovani foglie producono auxina ed il loro invecchiamento e distacco dalla pianta è in genere collegato ad una diminuzione di questo ormone.
- Promuovono la crescita dei frutti e ne impediscono il distacco dalle pianta. Anche in questo caso la caduta del frutto è correlata con una diminuzione del tasso auxinico.
- Determinano la dominanza apicale, le auxine prodotte dalle gemme apicali inibiscono lo sviluppo delle gemme laterali, quest’ultime possono quindi svilupparsi solo quando la gemma apicale viene recisa.
Come stato già detto le auxine vengono sintetizzate nei meristemi e ciò è nelle zone di attiva crescita delle piante, come il meristema apicale. Inizialmente si credeva che anche il meristema radicale producesse questo ormone, mentre sembra che non si formi a livello delle radici e la quantità di auxina che si trova normalmente è discesa dalle zone limitrofe del fusto.
Quindi lo spostamento dell’auxina avviene mediamente uno basipedo ciò è dall’alto verso il basso infatti sperimentalmente si può notare che l’ormone è altamente direzionale: se si prende un frammento di apice, chiamando “A” e “B” le sue estremità messe a contatto con cubetti di gelatina,dopo un certo tempo si avrà tantissima auxina in “B” e pochissima in “A”. Se si capovolge il frammento mettendo ciò è in alto nonostante la gravità si ritrova sempre un maggior accumulo di auxina nella gelatina posto a contatto con la zona “B” . Questo dimostra che lo spostamento dell’ormone e specificamente basipeto.





Un altro fenomeno a cui è interessata l’auxina è il geotropismo.




Il geotropismo ,positivo o negativo è il fenomeno per cui il germoglio di una pianta cresce verso l’alto, mentre la sua radice cresce verso il basso.
Infatti se io prendo un seme e lo pongo orizzontalmente noto che dopo qualche tempo esso cresce piegandosi verso l’alto mentre la sua radice si dirige verso il basso.
Nel giovane fusticino l’auxina si accumula per gravità lungo la metà inferiore, in una quantità maggiore rispetto alla zona corrispondente in alto e questo aumenta la distensione della cellula in questa parte più che quella superiore.
Per conseguenza l’estremità del germoglio si volge verso l’alto.
A livello della radice l’ormone si accumula in modo più o meno analogo che nel fusto.
Ma qui i tessuti sono più sensibili all’auxina, per cui una dose molto elevata della stessa produce una reazione opposta, ha un effetto inibidente sulla crescita: la metà inferiore avrà quindi una crescita limitata mentre quella sovrastante si allungherà di più facendo curvare la radice verso il basso. Inoltre l’auxina caratterizza il fototropismo : fenomeno per cui semplicemente illuminando la pianta con una luce laterale avrò una crescita preferenziale nella direzione di provenienza della luce.
Se si pone una fonte luminosa lateralmente al germoglio e la pianta s’inclina verso la luce e si va a determinare la concentrazione dell’auxina nella zona buia si troverà circa il 70% dell’auxina e solo il 30% nella zona illuminata. Ciò che determina la diversa percentuale di auxina tra la zona buia e quella illuminata è che i tessuti non illuminati hanno un potenziale elettromagnetico più elevato. Inoltre l’auxina esposta alla luce viene fotossidata dalla luce stessa, per cui diminuisce la sua concentrazione ulteriormente.





Di conseguenza nella parte in ombra più ricca di auxina si ha una distensione maggiore rispetto alla parte in luce per cui il germoglio cresce dirigendosi verso di essa.
La somministrazione di auxina da sola o con altri ormoni in cellule coltivate in vitro è indispensabile nei terreni di coltura per la crescita della maggior parte delle cellule vegetali.
Possono capitare così dove cellule che dipendono dall’aggiunta dell’ormone al terreno di coltura riescono , dopo successivi trasferimenti in terreni sempre più poveri di auxina, a renderli indipendenti.


Come ormoni con ruolo di divisione cellulare abbiamo la gibberellina e le citochinine .





LE GIBBERELLINE




Le gibberlline stimolano la crescita delle piante e l’espansione fogliare influendo, sia sulla divisione che sull’allungamento cellulare.
- L’effetto più evidente sulla pianta è un allungamento del fusto che cresce lungo e sottile,con pochi rami.
- Aumentando le dimensioni dei frutti specialmente se somministrati assieme alle auxine, stimolano come le auxine la produzione dei frutti,
- Interrompono la dormienza del seme, inducendo la germinazione: quando il seme inizia la germinazione, l’embrione rilascia gibberellina,questa si pensa possa essere responsabile dell’attivazione dei geni per la sintesi di enzimi idrolitici.



LE CITOCHININE




Le citochinine sono un indispensabile ingrediente di molti terreni per la coltura in vitro di cellule vegetali.
Esso stimola la crescita favorendo la divisione cellulare e non sostituibile da altri ormoni.
Gli effetti delle citochinine sulle piante sono:
- la stimolazione dell’espansione fogliare,
- il ritardo dell’appassimento delle foglie,
- sono indispensabili per la germinazione dei semi, agendo secondariamente alla gibberellina,
- determinano lo sviluppo delle gemme: nelle gemme ascellari per causa sconosciute non giunge questo ormone, che infatti sono dormienti anche a causa della dominanza apicale data dall’auxina applicando la citochinina si annulla l’effetto dell’auxina con conseguente sviluppo della gemma





L’aggiunta di citochinine a cellule vegetali coltivate in vitro ha, come effetto più evidente un rapido incremento della divisione cellulare, effetto tuttavia ottenibile solo in presenza di auxina.
Risulta molto importante quindi il rapporto quantitativo tra citochinina ed auxina presenti nel terreno infatti da esso dipende il mantenimento delle cellule allo stato indifferenziato a la loro differenziazione in radici e germogli sino allo sviluppo della pianta completa.


ACIDO ABSISSICO O DORMINA



Un altro ormone considerato il diretto antagonista dell’azione degli ormoni della crescita precedentemente descritti. è l’acido abscissico o dormina.
Non si conosce il suo luogo di sintesi, si sa solo che si accumula nelle foglie e nei frutti, poco prima del distacco dalla pianta.
Lo si trova inoltre nelle gemme e nei semi dormienti.
Le funzioni di questo fitormone quindi sono:
- accelera l’appassimento e il distacco delle foglie e dei frutti,
- Inibisce lo sviluppo delle gemme, infatti le gemme invernali sono ricche di questo ormone.
- Inibisce la germinazione del seme durante il periodo di dormienza.



ETILENE



Uno degli effetti più appariscenti dell’etilene sono la stimolazione della colorazione e della maturazione dei frutti.
L’etilene è un gas ed è l’unico ormone che si presenta sotto tale forma,mentre gli altri ormoni sono in soluzione.
- Dosi molto elevate di etilene determinano la dormienza, ma bassi livelli promuovono la germinazione di gemme.
- L’etilene inibisce la crescita delle radici, l’allungamento del fusto come antagonista delle auxine.
- E’ l’ormone responsabile dell’abscissione , fenomeno dove le foglie giovani producono molta auxina, ma con l’aumentare delle sue concentrazioni si ha un effetto contrario, ciò è si manifesta nella pianta un azione inibidente sullo sviluppo, perché alte dosi di questo ormone inducono la formazione di etilene (dall’ossidazione della stessa auxina) le foglie più mature, al contrario delle giovani , invece sono più delicate sensibili all’invecchiamento dato dall’etilene infatti in entrambe avviene la produzione con caduta tuttavia solo delle vecchie.

Infatti mettendo delle mele, che producono etilene, con dei kiwi acerbi se ne aiuta la maturazione, mentre se vengono messe in una cassa di patate si inibirà la germinazione.



Coltivazione in vitro

Dette le funzioni degli ormoni possiamo passare a come procedere per la coltivazione in vitro.
per prima cosa bisogna tener conto che la sterilità è un requisito essenziale per la coltivazione in vitro di cellulari,dato che i terreni nutritivi ottimali per questa coltivazione permettono anche la crescita di diversi microrganismi e muffe.
i tessuti interni della pianta sono generalmente sterili,mentre la superficie è ricoperta da microrganismi.
La rimozione di quest'ultimi risulta indispensabile se si vuole evitare la contaminazione dell'esperimento al momento dell'inizio della coltura in vitro.
Ciò si ottiene mediante semplici metodi di sterilizzazione superficiale.
Come descritto nel libro “colture di cellule vegetali: metodi ed applicazioni" PICCIN EDITORE , il metodo che ho utilizzato per la sterilizzazione è stato quello di immergere l'espianto vegetale dapprima in alcool al 90% per circa 3 minuti e dopo per trenta minuti in una soluzione contenente il 2% ipoclorito di sodio e qualche goccia di detergente,in modo da sciogliere i lipidi spesso presenti sulla superficie vegetale permettendo così alla soluzione sterilizzante di penetrare più profondamente. infine la soluzione e rimossa con numerosi lavaggi con acqua sterile.
Con questo processo si possono danneggiare le cellule esterne, ma non quelle interne che sono quindi disponibili per la coltura in sterilità.
Oltre al processo di sterilizzazione del campione deve esser eseguita anche la sterilizzazione del terreno e del contenitore.
Per questo ho posto i contenitori in una pentola a pressione avvolti da un panno per evitare che con gli urti dati dalla ebollizione dell’acqua potessero rompersi, vi ho messo l’acqua ( normale del rubinetto ) e ho fatto bollire l’acqua per circa 20 minuti dopo che la pressione è tornata nella norma ho estratto i vasetti.
Per la preparazione dell’espianto bisogna tener conto che i risultati migliori si ottengono usando cellule giovani in attiva proliferazione, errore che ho commesso nel mio secondo esperimento di cui ne parlerò di seguito, inoltre gli espianti devono essere a contatto con l’aria e non completamente sommersi dal terreno in modo da poter scambiare CO2 con O2 e viceversa.
Per la coltivazione delle piante ho incontrato un altro ostacolo, quello di riuscire a procurarmi il materiale per il substrato. Il terreno utilizzato è il Murashige e Skoog che possiede i macroelementi necessari per la crescita delle cellula vegetali, ( spesso viene arricchito con altre sostanze che variano a secondo del tipo di piante per aiutarne la crescita ) Infatti questo terreno viene venduto solo con apposite licenze, e la stessa cosa era per quanto riguarda l’agar e gli ormoni.
Sono riuscito mediante internet a contattare uno studente di Torino che in università lavora proprio in laboratori dove si coltiva in vitro per le ricerche, lui è riuscito a procurarmi ciò di cui avevo bisogno, permettendomi così di cominciare con i miei esperimenti.
Nella preparazione del terreno bisogna tener conto della concentrazione, dove per le piante carnivore è di 3ml di MS per 70ml di terreno totale, mentre per le altre piante è di 3,5ml, infatti queste piante crescono in terreni poveri di azoto, motivo per il quale esse si sono evolute diventando “carnivore” in modo da poter assorbire l’azoto dagli amminoacidi che costituiscono le proteine contenute negli insetti.
Dopo aver aggiunto l’acqua e il MS vi ho aggiunto l’ormone ( 0.03ml di citochinone per 70 ml ) e l’agar e dopo ho sterilizzato.

Per quanto riguarda l’illuminazione della coltura ho usato un terrario che uso per le piante carnivore tropicali o giovani, che non resisterebbero all’inverno,dove vi sono due neon Biolux con spettro di luce molto simile a quello del sole, con illuminazione giornaliera di 14 ore, anche se quella consigliata è di 16.
Come contenitori ho usato dei barattolini di vetro socchiusi con della garza sterile per evitare inquinamento della colture permettendo comunque un minimo di aerazione.
Come prima esperienza fatta il 3 dicembre del 2006 ho provato ad utilizzare semi di P. vulgaris pianta carnivora che cresce sulle alpi italiane, commettendo due errori, non era stata eseguita la stratificazione ( processo dove si fa credere al seme di aver superato l’inverno, avvolgendoli in una garza leggermente umida e mettendoli in frigo per circa 30 giorni ) infatti questi semi diventano maturi durante l’inizio dell’inverno e solo dopo la fine di questa stagione essi germogliano.
L’unico modo per poter accelerare i tempi era l’uso della gibberellina, che come detto permette al seme di germogliare evitando la stratificazione.
L’altro problema che avevo commesso era quello di posizionare i semi nel terreno e non in superficie impedendo il riciclo dell’aria.
Infine a causa della impossibilità di lavorare a casa in sterilità il 22 dicembre comparvero muffe,che dopo tre giorni invasero il terreno.
Il problema delle muffe alla fine si è rivelato un problema grave che mi impedì di portare a termine tutte le esperienze.
Il 15 gennaio riprovai con espianti di foglia di Dionea muscipula per la precisione una Red Dragon , varietà ottenuta per selezione che assume una colorazione rossa.
Commettendo tuttavia anche qui un grave errore infatti l’espianto della pianta era in dormienza, quindi era ricca di dormina, inoltre come detto prima era una foglia vecchia quindi aveva accumulato anche etilene e le cellule non erano di certo giovani e in attiva proliferazione. Il 24 gennaio il terreno si riempì di muffe.
Il 5 Maggio provai a porvi nel terreno delle piccole piante di Sarracenia hybride e di drosera facendo due terreni uno con l’ormone e un secondo senza, ma anche queste furono invase dalle muffe: il vasetto senza ormone il 18 maggio in modo evidente e quello con l’ormone il 16 maggio in modo evidente.


Da questi esperimento ho dedotto che il motivo che mi ha impedito la crescita della pianta è stato lavorare in ambiente non sterile, probabilmente dovuto anche ad una non corretta sterilizzazione del contenitore o del substrato o del materiale vegetale con il quale ho fatto la sperimentazione o forse qualche infiltrazione d'aria ,contenente spore di muffe o altri microrganismi contenuti nel terrario,nel contenitore.
Questo sottolinea ancor di più il fatto che per la coltura in vitro è necessaria una corretta sterilizzazione dei materiali pena un fallimento quasi certo.



















FOTO DELL’ESPERIENZA DEL 5 MAGGIO CON LE PIANTE.



5/06/07 Coltura con ormone.



5/06/07 Coltura senza ormone.



16/07/07 risultato della coltivazione della coltura con ormone

Pur troppo non ho potuto riportare le foto della coltivazione senza ormone con la muffa dato che mi è caduto per terra.






Michele Palazzo 5° C/A

















I FITORMOINI E LA COLTIVAZIONE IN VITRO DI PIANTE CARNIVORE









Bibliografia:
- Collezione personale di riviste AIPCNEWS (rivista specializzata in piante carnivore dell’associazione italiana piante carnivore)
- Colture di cellule vegetali: metodi ed applicazioni PICCIN EDITORE
- Sito : http://www.arcobonsai.com/Atti-92Poli.htm

[Modificato da ??Miky?? 09/07/2007 13.15]

[Modificato da ??Miky?? 09/07/2007 13.22]

Ottimo esperimento ( anche se il risultato non è stato positivo )!!.
Mi sto cimentando anch'io con la coltivazione in vitro, per ora sto provando con steli floreali di dionea ( nessuna fortuna ), e foglie di drosera capensis ( su una sta crescendo una protuberanza/callosità ).
Riguardo alla contaminazione del tuo ultimo esperimento ( 5 maggio ) permettimi queste considerazioni:
- se la contaminazione non è risultata visibile nei primissimi giorni dovrebbe significare che il materiale ( espianto, attrezzature... ) era correttamente sterilizzato e le muffe/contaminazioni sono entrate successivamente
- 'sigillare' il contenitore con una garza non ti garantisce sterilità per molto tempo
- l'aggiunta di un 'biocida' al terreno di coltura aiuta nel combattere le contaminazioni ( il biocida è utile anche nella sterilizzazione dell'espianto )

Se vuoi provare il biocida scrivimi che te ne posso inviare.

caspita si lo cercavo ma nn sapevo dove trovarlo, ho visto che se ne parlava in un sito inglese, durante la mia ricerca...
ma dopo quanto ti è cresciuta la potuberanza^ che terreno usi lo arricchisci con qualcosa in + ? e gli ormoni li usi?

[Modificato da ??Miky?? 10/07/2007 12.07]

Ho iniziato la coltura il 13 giugno. Come terreno di coltura ho utilizzato questa ricetta 'fatta in casa': http://www.omnisterra.com/botany/cp/slides/tc/tc.htm al 50%, a cui ho aggiunto NaDCC come disinfettante ( http://www.kitchenculturekit.com/nadcc.htm ), non ho aggiunto altri ormoni.
Ho messo in coltura:
- 2 pezzi di stelo floreale di dionea: 1 contaminato, 1 è diventato completamente marrone
- 2 pezzi di foglia di capensis: 1 ha sviluppato la protuberanza, 1 è diventato completamente marrone

capensis con protuberanza


P.S. il biocida che ho trovato ora è il Proclin 150 ( ha gli stessi principi attivi del PPM che viene pubblicizzato in giro )

[Modificato da davidefa 10/07/2007 13.38]

ma dove l'hai preso il funghicida?

Il Proclin l'ho preso alla Sigma, 50mL equivalenti a 500mL di PPM

ma la sigma sai se riesce a vendermi del MS che mi serve. quello che avevo ormai è andato a male...
se per caso qualcuno ha del terreno di coltura da vendermi insieme a del funghicida mi contatti anche via mail!!! grazie mille!!!
( possiedo per il momento la giberellina e citochinine, e agar per solidificare )

Per la Sigma li puoi contattare tranquillamente ( devi avere la partita iva o appoggiarti a qulcuno che la ha ) per il primo ordine chiedono 20 euri di spese di spedizione, per gli ordini successivi effettuati via web ( devi chiedere l'attivazione degli ordini web ) le spese di spedizione sono 10 euri. Se ti registri ( è gratuito ) sul loro sito puoi vedere la disponibilità e il prezzo degli articoli.

Io ho disponibile 1 bustina di MS519 ( phytotechlab.com è l'MS classico con vitamine ) da 4g ( per preparare 1 litro di MS al 100% ) 5 euri ( incluse le spese )

ma guarda io ho mandato una mail (tra l'altro in inglese e mi hanno risposto in italiano) e mi hanno detto che vendono i prodotti SOLO a scopo di ricerca!

E perchè tu ci vuoi giocare a carte con quei prodotti?
Gli puoi rispondere tranquillamente che li usi per ricerca, io direi che non bisogna lavorare per una multinazionale o ad una università per fare ricerca, si può fare anche dentro casa...

P.S. Se vuoi comperare da loro ti consiglio di registrari sul sito, prepara l'ordine con i codici, le descrizioni ed i prezzi che trovi sul sito, lo invii per fax al numero di Milano, poi saranno loro a contattarti per i chiarimenti ( ti ricordo di 'appoggiarti' a qualcuno che ha una partita iva )

grazie mille sei stato davvero gentile ^^

Qualcuno ha del substrato di coltivazione da vendermi?

Leggiti prima il regolamento e presentati nella sezione di benvenuto